摘要 [目的]对施钾调控烟草根系酚酸的释放及其防控青枯病进行研究。[方法]通过田间试验研究施用不同量的钾肥对烟草青枯病的防控效果，同时测定根系分泌物中的酚酸种类和含量，及其对烟草青枯病病原菌（Ralstonia solanacearum）的抑制作用。[结果]当田间施用150 kg/hm.2的钾肥时，烟草青枯病发病率和病情指数最低，根际土壤中青枯病病原菌的数量最少，为5.6 log CFU/g，而无钾肥处理的发病程度最高。同时，测定烟草根系分泌物中的酚酸发现，150 kg/hm.2处理的肉桂酸、水杨酸和苯丙酸释放量最高。外源添加酚酸对青枯病病原菌的生长结果表明，低浓度促进了菌丝生长，当浓度达600 mg/L 时则表现为抑制作用。此外，在田间中施钾肥显著提高了烟草的生物量、钾浓度和总酚含量。[结论]施用150 kg/hm.2钾肥时，能在农业上有效地防控烟草青枯病，其根系分泌物中的酚酸能显著抑制致病菌的生长。
关键词 烟草青枯病；钾肥；发病率；酚酸
中图分类号 S435.72 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0118-03
Abstract [Objective]To study the regulation on control of tobacco bacterial wilt and phenolic acid release from tobacco roots by application of potassium fertilizer.[Method] The effect of different amount of potassium fertilizer on tobacco bacterial wilt was studied by field experiments， and the inhibitory effect of the pathogen of Ralstonia solanacearum on phenolic acids from root exudates was determined. [Result]When the application of potassium fertilizer was 150 kg/hm.2 in field trial， the incidence and index of tobacco bacterial wilt were the lowest， the number of R. solanacearum in rhizosphere soil was least， which was 5.6 log CFU/g， but no potassium treatment was the worst. Meanwhile， analysis of phenolic acids showed that the 150 kg/hm.2 treatment had the highest amount of cinnamic acid， salicylic acid and phenylpropionic acid from tobacco root exudates. Exogenous phenolic acids added to affect the growth on the pathogen of R. solanacearum showed that low concentration promoted the growth， and the inhibitory effect was achieved when the concentration reached 600 mg/L. In addition， potassium application were significantly increased tobacco biomass， potassium concentration and total phenol content in field trial. [Conclusion]The application of 150 kg/hm.2 potassium fertilizer could effectively control tobacco bacterial wilt in field trial， and the phenolic acids from root exudates could significantly inhibit the growth of R. solanacearum.
Key words Tobacco bacterial wilt；Potassium fertilizer；Disease incidence；Phenolic acids
煙草（Nicotiana tabacum L）是茄科烟草属经济作物，在我国主要种植于长江流域和西南地区 [1-2]。处于我国西部地区的贵州省由于具有优越的土地资源和水利条件，因此适宜烟草种植[2-3]，但长期连续种植烟草，以及气温高和空气湿度大等环境因素，导致烟草病害发生严重，特别是难以防治的土传病害，容易造成烟草产量和品质下降[3-4]。烟草青枯病是一种危害严重的土传维管束病害，由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起，发病后烟草叶片支脉间出现黑色的斑纹，根系变黑腐烂，最终整棵植株叶片枯萎[4]。使用化学农药虽然能控制病害的发生和传播，但是过量使用农药不但造成烟叶品质下降，还容易造成环境污染问题[4-5]。利用科学的施肥策略防控病害发生，对提高烟草产量和品质，以及维持烟草产业的持续性发展，具有重要的理论和实践意义。
钾是植物生长发育所必需的营养元素之一，其参与植物生理过程中的各种生化反应，还能增强植物在病虫害、干旱、盐害等胁迫下的抗逆能力[6-7]，也能调控植物产生次生代谢产物（例如酚类）抵抗病原菌的侵染[7-8]。研究发现，施钾肥能有效抑制柠檬流胶病、玉米茎腐病、山茱萸炭疽病和油菜黑斑病的发生[6-9]。目前关于钾对植物的抗性机理研究主要在地上部分，而地下部根系是植物吸收营养和水分的主要器官[9-10]。根系分泌物能为土壤微生物提供大量的营养物质，且分泌物中的酚酸物质与连作障碍有密切的关系[10-11]。笔者在前人研究基础上，通过设置田间试验，研究不同施钾肥水平对烟草青枯病的防控效果，鉴定烟草根系分泌物中酚酸的种类和含量，并测定这些酚酸对抑制烟草青枯病病原菌生长的影响。
1 材料与方法
1.1 试验地及材料
试验于2017年在贵州省毕节地区烟草种植试验地进行，土壤基本理化性质：pH 5.5，有机质12.3 g/kg、速效氮114.8 mg/kg、速效磷13.9 mg/kg、速效钾98.2 mg/kg。烟草移栽时间为2017年4月13日，烟草青枯病调查时间为7月8日。选用烟草品种为青枯病敏感品种DJY。
1.2 试验方法
田间试验设置5个处理，分别为K0无钾肥；K75施用75 kg/hm.2 钾肥；K150施用150 kg/hm.2 钾肥；K225 施用225 kg/hm.2 钾肥；K300施用300 kg/hm.2 钾肥，钾肥为K2O。氮和磷的施用量為氮肥100 kg/hm.2、磷肥P2O5 75 kg/hm.2。每个处理小区面积为64 m.2，设置3个重复，采用随机区组设计。田间管理参照当地烟草栽培生产技术。
1.3 测定项目及方法
在调查烟草青枯病时，采取以下病害的分级方法：0级，烟草无病斑；1级，烟草茎部偶有褪色病斑，或有条斑一侧有少数叶片凋萎；2级，茎部有黑色条斑，但尚未达到烟草顶部，或发病一侧有1/2以上叶片萎蔫；3级，烟草茎部的黑色条斑达到植株顶部，或病侧有2/3以上叶片凋萎；4级，植株基本枯死[12]。病情指数的计算方法：（∑各级数×该级株数）/（最高等级数×调查总株数）×100[13]。每个处理取5个点进行调查，每个点选取10株，一共调查50株烟草，逐一记载烟草病害分级。调查完烟草青枯病后，采集烟草植株进行各指标检测，主要包括整株生物量、钾和总酚含量，每个指标为3次生物学重复。同时将烟草青枯病发病植株带回实验室进行病害鉴定，以确定病原菌为Ralstonia solanacearum。 同时采集烟草根际土样品，每个处理随机选取5株进行根际土收集，将样品保存于4 ℃冰箱，测定土壤中青枯病病原菌的数量，在SMSA培养基上统计病原菌[12]。
指标测定方法：将收获的烟草样品先在105 ℃下杀青30 min，然后于75 ℃下烘干至恒重后称重为生物量；将样品粉碎，利用H2SO4-H2O2进行消煮，用火焰光度计法测定植株的钾浓度；总酚含量测定：取1 g样品，加入5 mL含有1% HCl的甲醇溶液，提取24 h，取0.1 mL提取液稀释，定容至5 mL摇匀，用分光光度计测280 nm处OD值为总酚含量。SMSA培养基用于根际土壤中烟草青枯病原菌数量的测定[12]。
烟草根系分泌物的收集及鉴定：烟草种植30 d后将其从田间取出，用灭菌水清洗烟草根系，然后放入1 000 mL塑料杯中置入光照培养室培养24 h（16 h光/8 h黑暗），将塑料杯中的液体在冷冻干燥机中冻干待用，用于测定分泌物中的酚酸，每个处理3次重复。依据Ling等[14]的方法，采用高效液相色谱（HPLC，Agilent 1200，USA）进行酚酸测定，通过外标法计算出各酚酸在根系分泌物中的组成和含量。依据HPLC的结果，配制根系分泌物中的3种酚酸溶液，分别配制成酚酸含量为0、100、200、400、600 mg/L的培养基，测定3种酚酸溶液对病原菌生长的影响[12]。
1.4 数据统计与分析
用Excel 2016 对原始数据进行处理，利用SAS9.0对数据进行多重比较分析。
2 结果与分析
2.1 田间不同钾肥施用量对烟草青枯病发病的影响
施钾肥能显著降低烟草青枯病害的发生（表1）。当施钾量为K150（150 kg/hm.2）时，发病率和病情指数最低，K225（225 kg/hm.2）处理次之，无钾肥处理K0（0 kg/hm.2 ）最高。K150处理较K75（75 kg /hm.2）和K0（0 kg /hm.2）处理的发病率分别降低了24%和31%，病情指数分别降低了20%和32%，但是施钾量为K300（300 kg/hm.2）时，其发病程度反而比K150处理增加。在烟草土壤根际土中的青枯病病原菌含量上，K150处理的病原菌含量是最少的，分别比K0和K75降低了32%和11%，K0处理中青枯病病原菌含量最高。说明施钾能显著降低烟草青枯病害的发生，同时减少了病原菌在根际土壤中的含量，但并不是钾肥施用越多，其发病程度就越低。
2.2 田间不同钾肥施用量对烟草生物性状的影响
施钾显著提高了烟草的生物量、钾浓度和总酚含量（表2）。烟草的生物量表现为K225最高，K300次之，K0最差。K225处理的烟草生物量分别比K0和K75处理显著提高了94%和57%，但是K150与K225和K300处理之间生物量没有显著性差异，说明需要适量施用钾肥，并不是钾肥施用量越大，其生物量就越高。在植株的钾浓度和总酚含量的指标上，钾肥施用量越多，植株钾浓度越高。K300处理的钾浓度分别比K0和K75提高了60%和23%。在总酚含量上可看出，K150处理的总酚含量最高，但是与K225和K300处理之间差异不显著，但这3个处理的总酚含量均显著高于K0和K75处理。
2.3 田间不同钾肥施用量对烟草根系分泌物中酚酸含量的影响
钾水平显著改变了烟草根系分泌物中酚酸的含量（表3）。在肉桂酸含量上，K150处理含量是最高的，K225处理次之，K0含量最少。例如，K150处理的肉桂酸含量分别比K0和K75处理显著提高了3.75和1.53倍。虽然K300处理的施钾肥量是最高的，但与K150处理相比，还显著降低了肉桂酸的分泌量。在水杨酸含量上，K150处理含量是最高的，但是K225和K300处理的含量与K150差异不显著，且均显著高于K0和K75处理的水杨酸含量，K150处理分别比K0和K75处理显著提高了1.71和0.72倍。在苯丙酸含量上，K150处理也是最高的，K225处理次之，K0含量最少。K150分别比K0和K75处理显著提高了2.96和1.73倍。说明在田间施用不同量的钾肥，能显著调控烟草根系分泌物中的酚酸含量，在K150处理中，肉桂酸、水杨酸和苯丙酸的含量均是最高的，K0处理最低。
2.4 添加不同浓度和种类酚酸对烟草青枯病病原菌菌丝干重的影响
由表4可知，添加不同浓度的酚酸对烟草青枯病病原菌菌丝干重有显著的影响，均表现为低浓度的酚酸能促进病原菌的生长，当浓度高于400 mg/L时，表现为抑制作用，当浓度达600 mg/L时，有显著的抑制效果。在肉桂酸上，当浓度为200 mg/L时，烟草青枯病病原菌菌丝干重较0 mg/L处理显著提高了10%，但比浓度为600 mg/L时的抑制效果显著降低了25%。水杨酸和苯丙酸也有相同的趋势，当浓度为600 mg/L时抑制效果最明显。
3 讨论与结论
该研究证明了在田间中施用适量的钾肥（150 kg/hm.2），能显著降低烟草青枯病的发病率和病情指数，同时病原菌在根际土壤中含量最少。相对于其他的施钾肥处理，K150处理的烟草青枯病发病程度最低，其主要是由于施钾增加了烟草的生物量，提高了植株的钾浓度，以及与抗病相关的总酚含量。同时，施钾调控了烟草根系分泌物中酚酸物质的含量，K150处理显著增加了肉桂酸、水杨酸和苯丙酸含量，测定酚酸对烟草青枯病病原菌的影响时，表现为低浓度促进菌丝生长，而高浓度抑制。当施钾量超过150 kg/hm.2时，并没有显著降低烟草青枯病的发生，反而有增加的趋势，根系分泌物中的酚酸含量也有所降低，这表明在田间施用钾肥，应该按照作物所需供肥，实现植株生物量和抵抗病害的利益最大化。
钾元素具有提高植物抗逆境胁迫的功能，当植物受到病原物侵染时，可通过调节酚类代谢抵御病原菌的侵害，从而提高植物的抗病性[6-9，11，15]。该研究发现，施钾肥能显著提高烟草对青枯病害的抵抗，施钾肥后通过提高植株中的总酚含量，降低了烟草青枯病的发病程度。这与前人的研究报道相似，喷施钾肥提高了小麦叶片中酚类物质含量，从而增强了小麦对白粉病的抵抗能力[16]；施钾提高了棉花中棉酚含量，而棉酚含量的提高则降低了黄萎病害的发生[17]。同时，该研究发现田间施钾可显著增加烟草钾浓度，钾浓度提高，可增加植物细胞壁的厚度，能在物理屏障上抵御病原菌的入侵[9，11]。在烟草根际中，K150处理的病原菌含量最少，这主要是由于施钾调控了烟草根系分泌物中的酚酸物质，酚类物质的种类和浓度对根际土壤微生物的分布具有一定的影响，能促进或抑制土传病原菌的繁殖，改变植物的根际微环境[13-15]。
根系分泌物中的酚酸是重要的化感物质，已有多种酚酸被证明能显著抑制病原菌的生长和繁殖[13-15]，这些酚酸物质可以通过HPLC、GC/MS等仪器进行分离鉴定。该研究通过HPLC鉴定出3种酚酸类物质，分别为肉桂酸、水杨酸和苯丙酸，并通过研究其对烟草青枯病病原菌生长的影响，发现3种酚酸均呈现低浓度促进病原菌生长，高浓度抑制的效果。这结果与谭秀梅等[18]研究结果是相似的。同时，Gao等[13]研究发现，当外源添加浓度为40 mg/L的肉桂酸時，能显著抑制大豆红冠根腐病病原菌的生长和产孢。Hao等[19]发现水杨酸显著促进西瓜枯萎病病原菌孢子的萌发，但浓度达80 mg/L时却抑制了孢子的萌发，其抑制率可达65%。此外，水杨酸被认为是植物抗性通路中的重要物质，能提高植物对病原菌的抗性[19-20]。因此，可以推断烟草根系分泌物中的酚酸物质是抑制烟草青枯病发生的化感物质之一。同时，施钾提高作物对病害抗性的机制，并不是改变根系分泌物这一条途经，钾对防治烟草病害的抗性机理有待深入探讨。
研究表明，在田间钾肥施用量为150 kg/hm.2时，能有效地降低烟草青枯病的发病程度，提高植株的生物量、钾浓度和总酚含量；也能增加根系分泌物中的肉桂酸、水杨酸和苯丙酸浓度，这些酚酸在浓度为600 mg/L时能显著抑制烟草青枯病病原菌的生长。该研究为施钾在农业生产上防治烟草青枯病的发生提供了简单可行的策略和理论依据。
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